Si prepara la festa di Dioniso, ma Dafne non partecipa alla gioia comune e nell’arioso “O bleib’, geliebter Tag!” esprime il suo turbamento per il declinare del sole, che dà vita al mondo naturale, da lei amato più della civiltà umana. Nascosto dietro un albero, Leucippo l’ha udita, e ora si mostra per rimproverarle l’indifferenza con cui ella lo tratta; quando Dafne confessa di preferire a lui il suo flauto, che egli suona con tanta arte, Leucippo spezza rabbiosamente lo strumento e si allontana. La festa incomincia e sopraggiunge uno sconosciuto, cui Peneo offre ricetto, invitando Dafne a intrattenerlo. Lo straniero è in realtà Apollo, che turba e affascina la fanciulla, parlandole della natura con le identiche parole usate da lei poco prima; ma quando la stringe a sé in un bacio, Dafne si sente ingannata e si allontana dal dio. Travestito da donna, Leucippo si è unito alle ancelle di Dafne per poterle stare vicino. Tra Leucippo e Apollo nasce un diverbio, attizzato dalla reciproca gelosia; dopo aver rivelato la propria identità, il Sole-Apollo scaglia una freccia contro il pastore, uccidendolo. Pentita della propria freddezza, Dafne si dispera; di fronte al suo dolore innocente Apollo prova una grande compassione, e supplica gli dèi di concederle l’immortalità fra la natura che ha amato tanto così che, sotto forma di alloro, possa conoscere solo i più eletti fra gli uomini, sfiorandone castamente la fronte.