ATTO PRIMO
Jenufa è la figlia adottiva della Kostelnicka, l’austera sagrestana della chiesa di un paesino della Slovacchia morava. È amata da due fratellastri: il ricco Števa, del quale è promessa sposa, e il povero Laca, prostrato da un rabbioso dolore per non essere il preferito. Jenufa attende un figlio da Števa e aspetta al mulino il suo ritorno dalla commissione di leva. Se egli dovesse partire per il servizio militare e non si potesse celebrare subito il matrimonio, la sua gravidanza verrebbe scoperta, a suo disonore. È tesa e preoccupata. La vecchia Buryja la invita ad aiutarla nel lavoro. Laca la stuzzica, senza riuscire a suscitare interesse in lei. Jenufa si mostra una giovane buona e istruita: ha infatti insegnato a scrivere al pastorello Jano, che giunge entusiasta a mostrarle i suoi progressi. Laca confida al mugnaio che spera di veder partire soldato il rivale Števa; invece questi è stato esonerato e arriva al mulino completamente ubriaco per la felicità con un gruppo di musicanti. Jenufa lo richiama alle proprie responsabilità, ma Števa non ha voglia di pensare al matrimonio. Tutti danzano, ma la festa viene interrotta da Kostelnicka, che, vedendo Števa ubriaco, impone che il matrimonio con Jenufa sia rimandato di un anno per verificare se il comportamento del fidanzato mostrerà un miglioramento. Laca torna a tormentare Jenufa; le dice che Števa in lei ama solo il suo splendido volto, non il cuore. Ella, esasperata, lo fa ingelosire a tal punto che questi le sfregia la guancia con un coltello.
ATTO SECONDO
Alcuni mesi dopo. Jenufa ha partorito da pochi giorni il bambino. Tutti la credono a Vienna a servizio, ma lei ha vissuto nella casa della matrigna, nascosta agli occhi del paese. Jenufa è provata ma felice per l’evento. La matrigna la manda a dormire dopo averle somministrato un forte sonnifero. Poi convoca Števa per convincerlo a sposarla. Ma questi non ne vuole sapere: Jenufa non le piace più con il volto sfregiato. È pronto a pagare per il mantenimento del figlio, ma non vuole che la paternità venga svelata, anche perché nel frattempo si è fidanzato con la figlia del sindaco. Kostelnicka convoca allora Laca, che si mostra molto cambiato. È serio, responsabile e pentito del suo gesto: si dichiara pronto a sposare Jenufa, che continua ad amare con grande devozione. Ma quando apprende da Kostelnicka che la figliastra è appena divenuta madre, si irrigidisce per un attimo all’idea di accettare con lei anche un figlio di Števa. Allora Kostelnicka gli racconta che il bambino è morto e lo allontana con una scusa. Dopo qualche momento di straziante riflessione, Kostelnicka decide di sopprimere il bambino ed esce con lui nella tempesta di neve che infuria. Jenufa si sveglia. È allarmata per la scomparsa del bambino e prega la Madonna. Al suo ritorno Kostelnicka mente ancora una volta: le narra che durante i due giorni in cui ella ha dormito il bambino si è ammalato, è morto ed è stato da lei seppellito. Convince quindi Jenufa ad accettare le nozze con Laca, che giunge per dichiararle il suo amore. Mentre i due si parlano, Kostelnicka appare scossa e in preda a oscuri presentimenti di morte.
ATTO TERZO
Nella abitazione di Kostelnicka fervono i preparativi per il matrimonio di Jenufa e Laca. Giunge anche la famiglia del sindaco con Karolka, la nuova fidanzata di Števa, mentre alcune ragazze si esibiscono in una danza popolare nuziale. Gli sposi si inginocchiano per ricevere la benedizione della nonna e anche Kostelnicka, da tempo vittima di crisi nervose per il rimorso del suo delitto, si accinge a benedirli. Ma in quel momento viene data tumultuosamente la notizia che il ghiaccio del ruscello ha restituito il cadavere di un bambino lì abbandonato: Jenufa riconosce gli indumenti del suo bambino. La folla la vuole linciare, ma Laca la difende; nel parapiglia generale emerge la voce della Kostelnicka, che discolpa Jenufa e si confessa autrice dell’infanticidio, fra lo sbigottimento generale. Mentre la donna viene consegnata alla giustizia, Jenufa le accorda il suo perdono; invita quindi Laca ad andarsene insieme a tutti gli altri, ma egli le resta accanto, rinnovandole per l’ennesima volta il suo amore: i due giovani si abbracciano e si incamminano verso la loro futura vita in comune.