ERSTES BILD
Mathis, der Hofmaler des Erzbischofs, arbeitet im Mainzer Antoniterkloster am Kreuzgang, als der schwerverwundete Bauernführer Schwalb und dessen Tochter Regina hereinwanken und Zuflucht suchen. Beide beeindrucken Mathis, der dem Mädchen ein Band und Schwalb ein Pferd schenkt, so dass sie ihren Verfolgern entkommen können. Der Maler gesteht Sylvester von Schaumberg, der mit einem Trupp Soldaten kommt, dass er den Flüchtigen geholfen hat. Der Offizier will Mathis zur Rechenschaft ziehen lassen.
ZWEITES BILD
Protestanten, Katholiken und Studenten diskutieren im Saal der Martinsburg die politische Situation. Der Erzbischof kehrt von einer Reise zurück und bringt eine Reliquie des heiligen Martin mit. Er unterhält sich mit Riedinger, Capito, Ursula und Pommersfelden. Dieser setzt durch, dass die Schriften der Protestanten verbrannt werden sollen. Ursula gibt Mathis einen neuen Auftrag; da trifft Sylvester ein und klagt den Maler an, den Rebellen geholfen zu haben. Mathis bestreitet dies nicht und bittet für die unterdrückten Bauern. Er wird nicht, wie Pommersfelden fordert, verhaftet, aber aus dem Dienst des Kardinals entlassen.
DRITTES BILD
Als Katholiken evangelische Schriften verbrennen wollen, bringen die Protestanten die Bücher in Riedingers Haus, um sie zu schützen. Capito verliest ein Schreiben Luthers, der den Erzbischof auffordert, zum Protestantismus überzutreten, was der schlaue Rat nicht ungern sähe, da dann die Geldnot des Kardinals mit einer reichen Heirat, etwa mit Ursula, beseitigt wäre. Diese aber will sich dafür nicht hergeben und sucht bei Mathis Schutz.
VIERTES BILD
Mathis erlebt, wie das Bauernheer Schloss Königshofen stürmt und Graf Helfenstein ermordet. Als er die Gräfin vor den wütenden Bauern beschützt, wird er niedergeschlagen. Schwalb führt die Bauern gegen das nahende Heer des Truchsess, wird geschlagen und fällt. Gräfin Helfenstein rettet Mathis. Der Maler kann sich mit Regina vor dem Strafgericht der Sieger in Sicherheit bringen.
FÜNFTES BILD
Der Erzbischof hat es abgelehnt, seinen Glauben zu wechseln; Ursula versucht vergebens, ihn für sich zu gewinnen.
SECHSTES BILD
Mathis ist mit Regina in den Odenwald geflohen. Der Maler hat im Traum Visionen und wird von Dämonen verführt. Erzbischof Albrecht erscheint in Gestalt des Apostel Paulus und zeigt ihm seinen künftigen Weg.
SIEBTES BILD
Mathis hat sich von der Welt zurückgezogen und mit letzter Kraft den in der Vision gesehenen Isenheimer Altar vollendet. Regina liegt im Sterben und gibt das von Mathis erhaltene Band zurück. Der Maler bleibt allein und schlägt ein letztes Angebot des Erzbischofs, bei ihm sein Ende zu erwarten, aus.