ATTO PRIMO
Mazepa è ospite nella casa del cosacco Kocubej: Maria, la figlia di Kocubej, è innamorata di lui anche se l’eroe, molto più vecchio di lei, è coetaneo del padre. Invano il giovane Andrej le dichiara il suo amore: Kocubej si oppone all’amore di Mazepa per la figlia e lo scaccia. Maria allora fugge con lui. Kocubej decide di denunciare Mazepa allo zar: afferma che è un falso patriota e sta trattando con gli svedesi contro la Russia.
ATTO SECONDO
Kocubej è imprigionato nelle segrete del castello di Mazepa: lo zar non ha creduto alle sue accuse e lo ha consegnato a Mazepa. Il vecchio viene torturato e interrogato dal suo carceriere. Mazepa vorrebbe fondare uno stato indipendente in Ucraina, del quale lui dovrebbe essere il capo; Maria, che non sa della prigionia del padre, viene informata dalla madre e vuole intercedere per salvarlo. Ma le due donne arrivano troppo tardi: Mazepa ha fatto decapitare Kocubej.
ATTO TERZO
Nella casa ormai in rovina di Kocubej, Andrej affronta in duello Mazepa, ma il cosacco lo ferisce a morte. Appare Maria, ormai impazzita, che prende tra le braccia Andrej morente e, ricordando gli anni felici della loro infanzia, gli canta una ninna-nanna.