ERSTER AKT
Der alte Pfarrer Jorg liest in Klopstocks »Messias«. Er und seine Glaubensbrüder erwarten sehnsüchtig Stiffelios Rückkehr, dessen Führung und Rat die verfolgte Sekte dringend benötigt. Als der längst Erwartete mit einigen Gästen, darunter auch Raffael, eintritt, ist der Jubel gross. Bald herrscht betretenes Schweigen, als Stiffelio eine Brieftasche vorzeigt, die ihm ein Schiffer ausgehändigt hat. Diese Brieftasche habe ein junger Mann verloren, der in der Morgendämmerung mit einer Dame in aller Eile aus dem Schloss davongerannt sei. Stiffelio wirft den Fund ins Feuer, weil er mit dieser Sache nichts zu tun haben möchte. Lina, seine Frau und Raffael aber, die ein Verhältnis haben, können ihre Unruhe kaum verbergen, so dass Linas Vater stutzig wird. Als Lina und Stiffelio allein sind, ist die junge Frau nahe daran, alles zu bekennen, kommt aber nicht dazu, weil Stiffelio von Stankar zu einer Besprechung abgeholt wird. Lina entschliesst sich, ihre Schuld in einem Brief niederzulegen, wird dabei aber von ihrem Vater überrascht, der das Schreiben zerreisst, um Stiffelio zu schonen. Beide verlassen die Halle. Raffael, der einen Brief an Lina geschrieben hat, schleicht herein und versteckt das Schreiben im »Messias«. Kurz darauf erscheint zufällig Friedrich, Linas Cousin, nimmt das Buch an sich und geht. Jorg, der alles beobachtet hat, hält Friedrich für verdächtig und erzählt Stiffelio, was er vermutet. Dieser nimmt das Buch in die Hand, der Brief fällt heraus. Stankar nimmt ihn an sich, zerreisst ihn und fordert Raffaei heimlich zum Duell.
ZWEITER AKT
Lina betet am Grab ihrer Mutter, wo sie von Raffael aufgesucht wird. Lina will nichts mehr von ihm wissen und fordert ihren Ring und ihre Briefe zurück. Stankar ist Raffael nachgegangen und bringt zwei Schwerter mit. Der Zweikampf beginnt. Der Lärm lockt Stiffello herbei, der endlich erfährt, dass Raffael Linas Liebhaber ist. Nun kämpft Stiffelio selbst gegen Raffael, wird aber durch Jorg, der ihn in die Kirche ruft und bittet, seiner Frau zu verzeihen, unterbrochen. Schwankend zwischen Rache und Vergebung fällt Stiffelio in Ohnmacht.
DRITTER AKT
Raffael ist geflohen und hat einen Brief hinterlassen, in dem er Lina bittet, ihm zu folgen. Jorg bringt die Nachricht, dass Raffael zurückgekehrt ist, um sich Stiffelio zu stellen. Dieser empfängt ihn und bittet, im angrenzenden Zimmer seiner Aussprache mit Lina zuzuhören. Stiffelio lässt Lina zu sich rufen und legt ihr die Scheidungsurkunde vor, die seine Gattin schliesslich unterzeichnet, aber beteuert, im Herzen stets treu geblieben zu sein. Stiffelio macht sich bereit, mit Raffael zu kämpfen, doch dieser ist inzwischen von Stankar gestellt und getötet worden. Jorg muss den von Entsetzen betäubten Stiffelio in die Kirche führen.
Dort hat sich die Gemeinde bereits versammelt, Stiffelio betritt die Kanzel. Er öffnet die Bibel, ohne hinzusehen, wo und liest aus dem Neuen Testament. Als der Geistliche die Stelle erreicht, bei der Christus der Ehebrecherin vergibt, ist auch Stiffelio bereit, seiner Frau zu verzeihen.