ATTO PRIMO
In Germania al principio del secolo XIX, sulle rive dello Salzbach, presso il castello del conte di Stankar. Stiffelio, alias Rodolfo Müller, capo di una non meglio definita setta assasveriana, già a suo tempo fuggito per le persecuzioni religiose, ha fatto ritorno, dopo la pace, nel castello del suocero Stankar, che ha organizzato una festa di benvenuto. Accolto da famigliari e amici, l’uomo narra un episodio che gli è stato riferito da un barcaiolo: questi percorreva all’alba il fiume quando, da una finestra del castello, scorgeva un giovane che, al culmine di un agitato colloquio con una donna, si gettava nelle acque, perdendo un portafogli (“Di qua varcando sul primo albore”). Stiffelio mostra l’oggetto ai presenti ma, immaginando che l’episodio nasconda qualche tresca amorosa e non volendo accusare nessuno, lo dà alle fiamme. Mentre i presenti commentano l’accaduto, Lina e Raffaele, riconosciutisi nei due amanti, manifestano il loro sgomento. Rimasto solo con Lina, Stiffelio è turbato dal suo comportamento, tanto più quando si accorge che la moglie non porta al dito l’anello nuziale. Stankar, anch’egli insospettito dal comportamento della figlia, la sorprende mentre scrive una lettera di confessione indirizzata a Stiffelio (“Ed io pure in faccia agli uomini”). Per evitare un tale dolore al genero, impone a Lina di distruggerla. Frattanto Jorg ha scorto Raffaele riporre una lettera in un libro, ma poiché esso passa successivamente nelle mani di Federico, cugino di Lina, il sospetto cade su quest’ultimo. Stiffelio, avvertito del fatto, si impadronisce della lettera: ma prima che possa leggerla, Stankar la distrugge. Mentre Stiffelio dà sfogo al suo furore e al suo atroce sospetto, Stankar affronta segretamente Raffaele e lo sfida a duello presso il cimitero.
ATTO SECONDO
È notte. Lina, in preda alla più viva agitazione, si aggira per il cimitero dove, scorta la tomba della madre, si getta in ginocchio implorando il perdono divino (“Ah, dagli scanni eterei”). Sopraggiunge Raffaele, che le dichiara ancora una volta il suo amore. Mentre la donna, pentita, chiede che le venga restituito l’anello nuziale, Stankar li sorprende e inizia a battersi con Raffaele. Stiffelio, richiamato dal clamore, si getta tra i due contendenti per dividerli e, disarmato Raffaele, gli stringe la mano in segno di amicizia. Il gesto suscita lo sdegno di Stankar che, incautamente, rinfaccia a Raffaele la propria improntitudine nello stringere la mano all’uomo che ha tradito. A questo punto Stiffelio vorrebbe vendicarsi; ma Jorg, giunto nel frattempo, gli ricorda la sua missione evangelica e il suo dovere di perdonare. Sopraffatto dall’emozione, Stiffelio perde i sensi.
ATTO TERZO
Raffaele è fuggito: Stankar, consapevole dell’impossibilità di vendicarsi e sopraffatto dalla vergogna, medita il suicidio. Ma quando Jorg gli rivela che ha convinto l’uomo a ritornare e ad affrontare Stiffelio, esulta al pensiero della futura vendetta. Durante il colloquio con il rivale, Stiffelio gli chiede come si comporterebbe se a Lina fosse restituita la sua libertà. Raffaele rimane perplesso; allora Stiffelio lo fa assistere di nascosto a un colloquio con la moglie, durante il quale le propone il divorzio. Disperata, Lina accetta ma, senza poter nascondere il suo intimo strazio, rivela a Stiffelio il suo amore per lui e la sua debolezza di donna abbandonata, della quale Raffaele ha approfittato (“Non allo sposo volgomi”). Sconcertato, Stiffelio vorrebbe vendicarsi del rivale: ma apprende che Stankar lo ha già ucciso. Sconvolto, e desideroso di fuggire da una casa dove si sono consumati il tradimento e il delitto, Stiffelio si reca a celebrare il servizio liturgico. Nella chiesa, con il cuore straziato e come in delirio, il ministro passa tra i fedeli. Tra questi riconosce anche Lina. Poi, aperto il Vangelo di Giovanni e leggendo il passo dell’adultera e le parole di perdono del Cristo, perdona a sua volta la donna che, tra la commozione dei presenti, cade ai suoi piedi.