ERSTER AKT
Als Opfer willkürlicher Gewalt hält Don Pizarro, der Gouverneur eines (spanischen) Staatsgefängnisses, politische Gefangene verborgen, unter ihnen seinen persönlichen Widersacher Florestan, einen Freiheitskämpfer. Dessen Gattin Leonore hat sich, als Mann verkleidet unter dem Namen Fidelio, bei dem Kerkermeister Rocco anstellen lassen, um auf diese Weise Zugang zu den Gefangenen zu erhalten. Sie vermutet ihren Gatten unter ihnen. Bisher ist es ihr noch nicht gelungen, in die unteren Gewölbe vorzudringen, da Rocco glaubt, sie könne den Anblick der ausgemergelten Menschen nicht ertragen. Marzelline, Roccos Tochter, hat sich in Fidelio verliebt und durchkreuzt damit die Heiratsabsichten des Schliessers Jaquino, dessen hartnäckiges Werben sie heftig abweist (Jetzt, Schätzchen, jetzt sind wir allein). Sie träumt von einem kleinbürgerlichen Glück mit Fidelio. (O wär ich schon mit dir vereint). Leonore sieht sich konfrontiert mit dem Widerspruch zwischen ihrer angenommenen Rolle als Gehilfe des Kerkermeisters und ihrer wahren Absicht: Sie will Florestan unter den Gefangenen suchen und befreien. Es ist offensichtlich, dass Rocco ihren Diensteifer missdeutet als heimliche Liebe zu seiner Tochter Marzelline; er stellt bereits die Hochzeit in Aussicht (Mir ist so wunderbar) und gibt Marzelline und Fidelio Ratschläge für ihr künftiges Eheglück (Hat man nicht auch Gold beineben). Im Gegenzug dazu gewinnt Leonore alias Fidelio sein Vertrauen und erreicht, dass er sie, gegen den Willen Pizarros, mit in die unteren Gewölbe des Kerkers nimmt. Rocco gibt aber zu bedenken, dass es ein Gewölbe gäbe, in das niemand eintreten dürfe; dort befände sich ein Gefangener, der auf Befehl Pizarros seit einem Monat täglich weniger zu essen und zu trinken bekäme. Leonore versichert, sie werde den Anblick mutig zu ertragen wissen (Gut, Söhnchen, gut).
Pizarro erscheint mit seinen Wachsoldaten und erfährt aus einem von Rocco übergebenen Brief, dass der Minister eine Untersuchung des Gefängnisses angeordnet habe, da er Opfer willkürlicher Gewalt darin vermute. Er selbst werde diese Untersuchung leiten. Pizarro sieht sich zu raschem Handeln gezwungen: Er will Florestan so schnell wie möglich umbringen lassen und gibt die Anweisung, dass ein Trompetensignal ertönen solle, sobald der Wagen des Ministers naht. (Ha, welch ein Augenblick). Als er Rocco bestechen will, den Mord auszuführen, stösst er auf Widerstand und beschliesst, selbst Hand an den Widersacher Florestan zu legen, nachdem Rocco vorher das Grab ausgehoben hat. (Jetzt, Alter, jetzt hat es Eile). Leonore, die weiss, dass Pizarro zu allem entschlossen ist, baut auf die Hoffnung, dass es ihr doch noch gelingen möge, Florestan ausfindig zu machen und zu retten. (Abscheulicher, wo eilst du hin? / Komm Hoffnung). Auf ihren (und Marzellines) Wunsch lässt Rocco eigenmächtig die Gefangenen für kurze Zeit in den Hof des Gefängnisses treten; Leonore versucht vergeblich, Florestan unter ihnen zu entdecken. Die Gefangenen betrachten die unerwartet freie Luft als Vision der Freiheit, fühlen sich aber zugleich belauscht (O, welche Lust). Rocco kann Fidelio berichten, dass er ihn in den untersten Kerker begleiten dürfe, um dort das Grab für den Gefangenen zu graben, der durch Pizarro umgebracht werden soll. Leonore vermutet, dass sie am Ende noch das Grab für den eigenen Gatten aushebt. Jaquino und Marzelline stürzen herbei und kündigen den wütenden Pizarro an, der Rocco wegen der Freilassung der Gefangenen zur Rede stellt. Rocco entschuldigt sich mit dem Namenstag des Königs, den er auf diese Weise hätte feiern wollen, und lenkt geschickt den Zorn Pizarros auf Florestan. Die Gefangenen nehmen Abschied vom Sonnenlicht und steigen wieder in die Gewölbe hinab.
ZWEITER AKT
Im untersten Kerker beklagt Florestan sein Los, tröstet sich aber damit, dass er seine Pflicht der Wahrheitsliebe erfüllt habe, und sieht in einer Halluzination Leonore als Engel der Freiheit; dann sinkt er völlig erschöpft zusammen (Gott! Welch Dunkel hier! / In des Lebens Frühlingstagen). Rocco und Leonore steigen in seinen Kerker hinab und beginnen, das Grab auszuheben (Nur hurtig fort, nur frisch gegraben). Leonore ist entschlossen, den Gefangenen, den sie im Dunkeln nicht erkennt, auf jeden Fall zu retten, auch wenn es nicht Florestan sein sollte. Bevor Rocco und Leonore dem Gefangenen aus Mitleid Brot und Wein reichen, erkennt Leonore plötzlich das Gesicht ihres Gatten, als er sich im Gespräch zu Rocco wendet. Er fragt auch nach dem Gouverneur des Gefängnisses und erfährt, dass es sein persönlicher Feind Pizarro ist. Rocco weigert sich, seiner Bitte nachzukommen, Leonore zu benachrichtigen, und beruft sich auf seine strikte Pflichterfüllung. Nachdem Florestan ihm und Leonore, die er nicht erkennt, für Brot und Wein gedankt hat, (Euch werde Lohn in bessern Welten), gibt Rocco mit einem Pfiff das Zeichen für Pizarro, der nun vermummt im Kerker erscheint. Als er sich Florestan zu erkennen gibt (Er sterbe! Doch er soll erst wissen) und ihn erstechen will, stürzt Leonore auf ihn zu, stellt sich vor Florestan und gibt sich ebenfalls zu erkennen. Sie schreckt nicht einmal davor zurück, auf Pizarro die Pistole zu richten, und hätte ihn sogar erschossen, wenn nicht von oben in diesem Augenblick das verabredete Trompetensignal erklungen wäre. Der Minister Don Fernando erscheint als Retter aller Gefangenen; Leonore und Florestan sinken sich in die Arme (O namenlose Freude). Marzelline muss einsehen, dass Fidelio sie getäuscht hat. Der Dank für Gottes Gerechtigkeit und eine Hymne auf Leonore (Wer ein holdes Weib errungen) bilden das emphatische Finale.